文獻(xiàn)背景

基本信息

摘要

研究結(jié)果與討論

1.[60]富勒烯的兩親性衍生物體外抑制腫瘤增殖

2.TAPC-4抑制癌細(xì)胞遷移并誘導(dǎo)MET

高遷移率和EMT是癌癥轉(zhuǎn)移的標(biāo)志。Transwell實(shí)驗(yàn)表明TAPC-3和TAPC-4可顯著降低腫瘤細(xì)胞的遷移率（圖2a）。TAPC-4增加了A549和DU145細(xì)胞中上皮標(biāo)志物（E-鈣粘蛋白）的表達(dá)，并降低了間充質(zhì)標(biāo)志物（波形蛋白、轉(zhuǎn)錄因子Snail、N-鈣粘蛋白）mRNA的表達(dá)水平（圖2b）。TAPC-4劑量依賴性地降低A549和DU145細(xì)胞中波形蛋白和N-鈣粘蛋白的蛋白表達(dá)，如Western（圖2c）和免疫熒光（圖2d）所示。因此，TAPC-4促進(jìn)了間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化（MET），這是EMT的逆轉(zhuǎn)過(guò)程。一種原癌基因蛋白Myc被顯著下調(diào)，其調(diào)節(jié)波形蛋白的表達(dá)以及EMT誘導(dǎo)和細(xì)胞遷移的相關(guān)途徑。波形蛋白的下調(diào)通過(guò)反饋來(lái)降低轉(zhuǎn)錄因子Snail的mRNA和蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子Snail通過(guò)抑制E-鈣粘蛋白的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)EMT，減少細(xì)胞連接，增加細(xì)胞遷移。

3.TAPC-4靶向特異性腫瘤調(diào)節(jié)劑

TAPC-4標(biāo)記了D-生物素得到了兩個(gè)產(chǎn)率相當(dāng)?shù)纳锼鼗疶APC-4異構(gòu)體，圖中為熱力學(xué)穩(wěn)定性相對(duì)較高的一種（圖3a）。Hsp90β，波形蛋白和MYH9可能是TAPC-4抑制腫瘤的靶點(diǎn)（圖3c），其在1-3帶MS評(píng)分最高，在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和EMT過(guò)程中起關(guān)鍵作用。TAPC-4與Hsp90、波形蛋白和MYH9的特異性結(jié)合相互作用通過(guò)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（圖3d）。TAPC-4誘導(dǎo)Cyclin D1表達(dá)下調(diào)和隨后的G0/G1細(xì)胞周期停滯（圖1h），表明TAPC-4與Hsp90的特異性相互作用可能通過(guò)PI3K/AKT途徑抑制Cyclin D1的翻譯。TAPC-4可能通過(guò)蛋白水解途徑結(jié)合波形蛋白并下調(diào)波形蛋白表達(dá)（圖2b-d）。TAPC-4與MYH9的結(jié)合并沒(méi)有改變其蛋白表達(dá)（圖3e），而是使MYH7從細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞邊緣，從而消除了腫瘤細(xì)胞的流動(dòng)性（圖3f）。

TAPC-4和TCPC-4與Hsp90β的疏水基團(tuán)結(jié)合主要是由于富勒烯碳籠和疏水基團(tuán)間的疏水相互作用（圖3g）。TAPC-4的氨基與HSP90的親水殘基形成多個(gè)氫鍵和靜電相互作用，促進(jìn)TAPC-4獲得比TCPC-4更多的負(fù)靜電能，增強(qiáng)與Hsp90β的結(jié)合（圖3h）。兩親性TAPC-4和TCPC-4都能與Hsp90β，波形蛋白和MYH9通過(guò)富勒烯碳籠與蛋白質(zhì)的疏水相互作用結(jié)合，TAPC-4的末端氨基酸部分可以與親水性氨基酸殘基形成固體靜電相互作用以增強(qiáng)其與靶蛋白的結(jié)合。因此，兩親性分子結(jié)構(gòu)和末端氨基使TAPC-4能夠與Hsp90β，波形蛋白和MYH9結(jié)合，這可能使其在體外具有高抗腫瘤功效。

4.TAPC-4在體內(nèi)的分布和排泄

BALB/c小鼠分別經(jīng)腹腔注射Cy5.5和Cy5.5標(biāo)記的TAPC-4（TAPC-Cy5.5）。取小鼠的主要臟器（心、肝、脾、肺、腎）在不同時(shí)間間隔（1.5~96h為短期，30d為長(zhǎng)期）進(jìn)行體外成像。游離Cy5.5積累在6小時(shí)達(dá)到最大值，大部分在96小時(shí)內(nèi)被快速排泄。TAPC-Cy5.5的熒光強(qiáng)度在6小時(shí)左右達(dá)到非常高的水平，隨后逐漸下降，30天后基本消失，表明TAPC-4可以被排出體外。TAPC-Cy5.5和游離Cy5.5主要分布在肝、腎、肺和脾。與Cy5.5在72 h內(nèi)被快速清除相比，TAPC-Cy5.5在30 h內(nèi)在腎、肺和脾中重新分布，并緩慢排出，72 h時(shí)只有少量排出，30 d后大部分排出。有報(bào)道稱水溶性富勒烯衍生物在肝、脾、肺和腎中積累，一個(gè)月后可從體內(nèi)清除，這與TAPC-4的分布和排泄一致。總之，TAPC-4主要分布在肝、脾、肺和腎中，并在幾天后排出，避免了長(zhǎng)期毒性。

5.TAPC-4抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)

在治療中未觀察到體重和主要臟器（心、肝、脾、肺和腎）重量的顯著變化，表明PEG-PO修飾后TAPC-4具有較高的生物相容性（圖5b）。PEG-PO在最大劑量下也不會(huì)引起腫瘤體積和腫瘤重量的變化，因此其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用可忽略不計(jì)（圖5c，d）。TAPC-4對(duì)腫瘤組織的收縮呈劑量依賴性，高劑量時(shí)對(duì)腫瘤體積變化的抑制指數(shù)達(dá)到75.5%。腫瘤切片的TUNEL和H&E染色顯示TAPC-4誘導(dǎo)腫瘤廣泛壞死（圖5e）。主要臟器（心、肝、脾、肺和腎）的H&E染色切片未見(jiàn)組織學(xué)損傷，表明TAPC-4在體內(nèi)有效劑量下具有較高的安全性。荷瘤小鼠體內(nèi)顯著升高的白細(xì)胞數(shù)量在TAPC-4治療后下降到正常范圍。TAPC-4降低了Cyclin D1的蛋白水平，消除了腫瘤組織中RB的磷酸化，表明TAPC-4可以誘導(dǎo)G0/G1細(xì)胞周期阻滯，抑制體內(nèi)腫瘤增殖。腫瘤組織中E-鈣粘蛋白上調(diào)、波形蛋白和N-鈣粘蛋白下調(diào)（圖5f），表明EMT通過(guò)TAPC-4被逆轉(zhuǎn)。因此，安全范圍內(nèi)的TAPC-4可在體內(nèi)外通過(guò)阻斷G0/G1期獲得顯著的抗腫瘤作用。

6.TAPC-4抑制體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移

B16-F10-Luc細(xì)胞靜脈植入BALB/c小鼠中誘導(dǎo)肺轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。每隔一天向小鼠靜脈注射100 μL生理鹽水、PEG-PO和PEG-PO包被的TAPC-4（圖6a）。在對(duì)照組中觀察到強(qiáng)烈熒光和大量肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，表明轉(zhuǎn)移率相對(duì)較高（圖6b-d）。TAPC-4治療時(shí)，黑色素瘤的發(fā)光強(qiáng)度下降，具有良好的治療效果（圖6c）。TAPC-4使肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的平均數(shù)量從40個(gè)減少到5個(gè)，抑制指數(shù)達(dá)到了87.5%（圖6e）。給藥24小時(shí)后，TAPC-4在肺、脾和肝中富集（圖6f），小鼠體重未下降，表明TAPC-4具有良好的生物相容性。因此，TAPC-4在體內(nèi)外通過(guò)逆轉(zhuǎn)EMT對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移具有顯著的抗腫瘤作用。

結(jié)論